【測(cè)定原理】

特布他林檢測(cè)ELISA試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物類藥物的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較可得出相應(yīng)殘留物類藥物的含量。

【試劑盒技術(shù)指標(biāo)】

特布他林檢測(cè)ELISA試劑盒規(guī)格：96孔敏 度： 0.1ppb/盒

靈 檢測(cè)時(shí)間：45min

樣本檢測(cè)下限：

組織樣本（雞、鴨、豬肉/肝、蝦、魚(yú)、雞蛋）

牛奶、蜂蜜樣本

樣本回收率：

組     織   …………………………………… 85%±20%

牛奶、蜂蜜  ………………………………  80%±20%

【試劑盒組成】

1、 微量測(cè)試孔：1×96孔板（12條×8孔）

2、 標(biāo)準(zhǔn)品溶液×6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb

3、 高濃度標(biāo)準(zhǔn)品：×1瓶：（1ml/瓶）100ppb

4、 酶標(biāo)記物       7ml………………………紅色帽

5、 抗體工作液   7ml ………………………綠色帽

6、 底物A液      7ml ………………………棕色帽

7、 底物B液     7ml  ……………………黑色帽

8、 終  止  液     7ml  ……………………黃色帽

9、 20X濃縮洗滌液40 ml  ………………白色帽

10、 2X 濃縮復(fù)溶液   50ml ·………………藍(lán)色帽

【 所用儀器、試劑】

具備的儀器：酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮 吹儀、刻度移液管。

微量移液器：?jiǎn)蔚?20μl～200μl、單道100μl～1000μl多道 30～300 μl

試劑： 甲醇、正己烷、Na2HPO4·12H2O、NaCl、NaH2PO4·2H2O

【實(shí)驗(yàn)前溶液配制】

配液1、20mM PBS緩沖液

5.16g Na2HPO4*12H2O；0.87gNaH2PO4*2H2O;8.5gNaCl；

加入蒸餾水至1000ml；用于樣品提取液的配制。

配液2、樣品提取液的配制

取1ml甲醇與9ml的20mM PBS緩沖液混勻。

配液3、 將2X濃縮復(fù)溶液用去離子水按1：1稀釋。(1份濃縮復(fù)溶掖+1份去離子水，用于抗體的稀釋和樣本提取后的復(fù)溶)。

配液4、將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照 1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按 所需用量配制洗滌液。

【樣本前處理步驟】

樣本處理前須知

（a）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時(shí)要更換吸頭。

（b）實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，必要時(shí)可對(duì)實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

樣本處理：

（a）組織樣本前處理方法（不用過(guò)柱）

1、 稱取1±0.05g 均質(zhì)后的樣本于離心管中，加入4ml樣品提取液，振蕩5min，室溫4000r/min 以上，離心10min；

2、 取1ml上清液收集于另一試管中;加入1ml 正己烷,振蕩1min，室溫4000r/min 以上，離心10min；

3、 取50 µl下層液體于另一容器中，加入200μl稀釋液混合30s；

4、 取50 μl 用于分析樣本稀釋倍數(shù): 20 倍。

（b）蜂蜜處理方法

1、 準(zhǔn)確稱取1±0.05g 蜂蜜樣本于離心管中，加入4ml 樣品提 取液，強(qiáng)烈混合振蕩5min，室溫 4000r/min以上，離心10min；

2、 取出50μl 上清液于另一試管中，加入450μl稀釋混合30s；

3、 取50 μl 用于分析樣本稀釋倍數(shù): 40 倍。

（c）牛奶樣品處理方法

脫脂牛奶

1、取出50μl 脫脂牛奶與1950μl稀釋液，混30s；

2、取50 μl 用于分析脂肪奶；

3、吸取1ml 牛奶樣本于離心管中；于15℃環(huán)境3000r/min，離心10min；（如果沒(méi)有冷凍離心機(jī)請(qǐng)預(yù)先冷卻后再離心)

4、取出50μl 牛奶于與1950μl稀釋液，混合30s；

5、取50 μl 用于分析樣本稀釋倍數(shù): 40 倍。

【 酶標(biāo)免疫分析程序】

操作步驟：

1、 將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 按板架及需要取出微孔條，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

4、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl /孔，然后加酶標(biāo)記物50μl/孔，再加入抗體工作液50µl/孔。輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，25℃環(huán)境反應(yīng)30min。

5、 取出用洗滌液按每孔250μl洗板4-5次，每次浸泡15-30秒，拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6、 顯色：每孔加入底物液A液50µl再加B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境避光顯色15min。

7、 測(cè)定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測(cè)定吸光度值（OD值）。

【結(jié)果判定】

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法 產(chǎn)品只用于科研。